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Se comenzó a construir por mandato de fray Julián Garcés, obispo de Tlaxcala, entre 1536 y 1539. Posteriormente las autoridades virreinales ordenaron la construcción de un templo más grande y vistoso, proyecto que fue encomendado en 1575 al arquitecto Francisco Becerra.
Sin embargo, la falta de dinero y los cambios administrativos hicieron que las obras se detuvieran en 1626.
En 1634 el maestro mayor de la Catedral Metropolitana de la Ciudad de México, Juan Gómez de Trasmonte, hizo una adecuación del proyecto, dándole un aspecto más clásico y una planta basilical. En 1640 una cédula real encomendó al obispo Juan de Palafox y Mendoza terminar la construcción, lo que se logró realizar ocho años y ocho meses después, y el 18 de abril de 1649, siendo dedicada el templo a la Inmaculada Concepción fue consagrada. En fechas posteriores se concluyeron portadas y fachadas, como la principal, llamada la puerta del Perdón, acabada en 1664, o la lateral de San Cristóbal, que mira hacia el norte, terminada en 1690.
La fachada principal fue realizada en cantera gris procedente del cerro de Guadalupe; en su decoración sobresalen detalles en piedra de villerías, que es una especie de cantera. En las portadas se aprecian esculturas con las imágenes de San Pedro y San Pablo, San José, Santiago el Mayor, Santa Rosa de Lima, San Miguel Arcángel, Santa Teresa de Ávila y San Gabriel Arcángel.
El interior es de gran belleza por los objetos artísticos que conserva en sus 14 capillas laterales y en el altar mayor, también llamado Altar de los Reyes, en donde destacan esculturas y pinturas con temas religiosos, estas últimas realizadas por Pedro García Ferrer en el siglo XVII.
El altar mayor fue diseñado por Manuel Tolsá y construido entre 1797 y 1818; de bajo de él se encuentran los restos de obispos poblanos; también son de interés las 14 pinturas en forma de medallón con escenas del Viacrucis, atribuidas a Miguel Cabrera, repartidas alrededor de la nave, el coro y los órganos.